L'analyse combinée du protéome et du métabolome donne un aperçu des microARN
Aug 02, 2023Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 271 (2023) Citer cet article
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Les virus pathogènes peuvent être transmis par des moustiques femelles Aedes aegypti (Ae. aegypti) lors de l'acquisition d'un repas de sang provenant de vertébrés. La désactivation du microARN (miARN) 1174 (miR-1174) spécifique aux moustiques et à l'intestin moyen altère la consommation de sang et augmente la mortalité. La détermination de l'identité des protéines et des métabolites qui répondent à l'épuisement du miR-1174 améliorera notre compréhension des mécanismes moléculaires de ce miARN dans le contrôle de l'alimentation sanguine et du métabolisme des nutriments des moustiques.
Des oligonucléotides antisens (antagomirs [Ant]) Ant-1174 et Ant-Ct ont été injectés chez une femelle Ae. aegypti 12 à 20 heures après la closion, et l'épuisement de miR-1174 a été confirmé par PCR quantitative en temps réel par transcription inverse (RT-qPCR). Les moustiques injectés et témoins ont été collectés avant le repas de sang 72 heures après l'injection pour une analyse protéomique basée sur des étiquettes de masse en tandem et une analyse métabolomique non ciblée par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem afin d'identifier respectivement les protéines et les métabolites exprimés différentiellement. L'interférence ARN (ARNi) utilisant l'injection d'ARN double brin (ARNdb) a été appliquée pour étudier les rôles biologiques de ces gènes différentiellement exprimés. L’effet de l’ARNi a été vérifié par des tests RT-qPCR et Western blot. La teneur en triglycérides et les niveaux d'ATP ont été mesurés à l'aide des kits de test appropriés, en suivant les instructions du fabricant. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel GraphPad7 en utilisant le test t de Student.
Lors de l'épuisement du miR-1174 spécifique aux moustiques et à l'intestin moyen, un total de 383 protéines différentiellement exprimées (DEP) ont été identifiées, parmi lesquelles 258 ont été régulées positivement et 125 ont été régulées négativement. L'analyse fonctionnelle de ces DEP à l'aide de l'enrichissement de Gene Ontology (GO) et de l'Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) a suggéré que miR-1174 joue un rôle régulateur important dans le métabolisme des acides aminés, le métabolisme des nucléotides, le métabolisme des acides gras et les voies du métabolisme des sucres. Au total, 292 métabolites différentiels ont été identifiés, dont 141 étaient régulés positivement et 151 étaient régulés négativement. L'analyse intégrative a montré que les protéines différentielles et les métabolites associés étaient principalement enrichis dans diverses voies métaboliques, notamment la glycolyse, le cycle du citrate, la phosphorylation oxydative et le métabolisme des acides aminés. Plus précisément, le gène d'une protéine régulée positivement chez les moustiques appauvris en miR-1174, la purine nucléoside phosphorylase (PNP ; AAEL002269), était associé aux voies métaboliques de la purine, de la pyrimidine et de la niacine-nicotinamide. L'inactivation du PNP a sérieusement inhibé la digestion du sang et le développement des ovaires et augmenté la mortalité des adultes. Mécaniquement, la déplétion du PNP a conduit à une régulation négative significative du gène de la vitellogénine (Vg) ; en outre, certains gènes importants dans les voies de signalisation de l'ecdysone et des peptides de type insuline liés au développement des ovaires ont été affectés.
Cette étude démontre une accumulation différentielle de protéines et de métabolites dans Ae appauvri en miR-1174. aegypti en utilisant des techniques protéomiques et métabolomiques. Les résultats fournissent des preuves fonctionnelles du rôle du gène PNP régulé positivement dans les activités physiologiques intestinales. Nos résultats mettent en évidence des changements moléculaires clés dans l’Ae appauvri en miR-1174. aegypti et fournissent ainsi une base et de nouvelles informations pour une meilleure compréhension du mécanisme moléculaire impliqué dans un miARN spécifique à une lignée chez les moustiques vecteurs.
Les femelles des espèces de moustiques vecteurs prélèvent du sang sur des vertébrés pour obtenir les acides aminés et autres nutriments nécessaires au développement des œufs ; par conséquent, ils servent de vecteurs à un grand nombre d’agents pathogènes viraux. Avec l’urbanisation mondiale et le réchauffement continu du climat, le risque de maladies transmises par les moustiques augmente dans le monde entier, posant un sérieux défi à la santé publique et imposant un fardeau économique important à de nombreux pays [1]. Au cours des dernières années, une série de stratégies et de technologies prometteuses pour contrôler les moustiques vecteurs basées sur la manipulation génétique ont été de plus en plus acceptées [2,3,4,5]. Cependant, le manque d’interventions médicales efficaces limite encore la prévention et le contrôle de la plupart des maladies transmises par les moustiques.
1.2, as described in other studies [13,14,15,16] (Additional file 3: Table S3). The DEPs were subjected to GO enrichment [17] and KEGG pathway enrichment analyses [18]./p> 1 and P < 0.05 (unpaired two-sided Student’s t-tests) in the OPLS-DA model were considered to be differentially expressed metabolites (DEMs). Volcano plots and a hierarchically clustered heatmap were plotted to visualize significant features of the identified DEMs. Commercial databases, including KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) and MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), were used for pathway enrichment analysis. Finally, integrated analysis of the proteome and metabolome was performed for the differential proteins and metabolites./p> 1.8 was considered to be satisfactory for subsequent experiments. The integrity of the extracted RNA was checked by 1% agarose gel electrophoresis. All primer pairs for the real time quantitative PCR (RT-qPCR) amplification of genes were designed using the software Primer Premier 5.0 and then synthesized at Sangon Biotech (Shanghai, China) (Additional file 7: Table S7). To examine the expression of the protein-coding genes, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) using the SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). RT-qPCR was performed using TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). The reaction volume (20 µl) contained 10 µl of 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl ROX Dye II, 2 µl diluted cDNA and 6.8 µl ddH2O. Ribosomal protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA) served as the internal control. Reactions were conducted on an ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). The amplification procedure was: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 1 min and 60 °C for 1 min; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s. To examine the expression level of miR-1174, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA using the SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, China). RT-qPCR was performed using a miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). The total reaction volume (20 µl) contained 10 µl of miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl of 50× ROX Reference Dye II, 2 µl of diluted cDNA and 6.8 µl of ddH2O. Small nuclear RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) was used as the internal control. Reactions were conducted on the ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) using the following amplification procedure: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s./p> 1.2, as used in other studies [13,14,15,16], we determined 383 DEPs, of which 258 were upregulated and 125 were downregulated (Fig. 1c; Additional file 8: Table S8). Hierarchical cluster analysis showed that these 383 DEPs were separated into upregulated and downregulated clades, and that the Ant-1174 group was differentiated from the control group (Fig. 1d); thus, miR-1174 depletion substantially caused a global protein expression response in mosquitoes./p> 1.2 or < 0.83, P < 0.05) illustrating the proteins differentially expressed between the Ant-1174 and control groups. The significantly upregulated differentially expressed proteins are shown in red, the significantly downregulated differentially expressed proteins are shown in blue and the proteins with no significant difference are shown in gray. d Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed proteins visualized as a heatmap. The color blocks in different positions represent the relative expression of the corresponding proteins: red represents high expression and blue represents low expression. e Bubble chart showing GO enrichment of Ant-1174 vs Control. f KEGG pathways enriched by differentially expressed proteins between Ant-1174 and control group. Ant-1174/Ant-Ct, antisense oligonucleotides (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biological Process; CC, cellular component; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molecular function; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, postinjection; WT, wild type/p> 1 and P value (in a Student’s t-test) < 0.05 yielded 292 differential metabolites, of which 141 were upregulated and 151 were downregulated (Fig. 2d; Additional file 9: Table S9). Hierarchical clustering analysis of these differential metabolites showed that samples of the same group were clustered in one clade and those of different groups were separated from each other (Fig. 2e; Additional file 10: Table S10). The upregulated metabolites could be divided into 10 super classes, of which the top five were organic acids and their derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; organic oxygen compounds; and benzenoids (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). The downregulated metabolites could be divided into 11 super classes, of which the top five were organic oxygen compounds; organic acids and derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; and nucleosides, nucleotides and analogs (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). In the super class organic acids and derivatives, 41 metabolites (76%) of POS mode and 24 metabolites (69%) of NEG mode belonged to the subclass amino acids, peptides and analogs. In the super class organic oxygen compounds, eight metabolites (62%) of POS mode and 29 metabolites (81%) of NEG mode belonged to the subclass carbohydrates and carbohydrate conjugates. We then performed a KEGG pathway enrichment analysis of these DEMs (Fig. 2g; Additional file 12: Table S12), which revealed that the DEMs were mainly enriched in the pathway aminoacyl-tRNA biosynthesis, followed by purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, galactose metabolism, pyrimidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, arginine and proline metabolism, pentose and glucuronate interconversions, alanine, aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism, lysine degradation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, sphingolipid metabolism and glyoxylate and dicarboxylate metabolism./p>
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